[ 싱글셀 분석 ] 10x Cell ranger 정복하기 1

Cell Ranger 이란? (v7.1)

Illumina 의 Chromium single cell data 를 align 하고 feature-barcode matrics를 만들고, clustering secondary analysis 등을 하기 위한 분석 파이프라인 set 입니다. Cell ranger을 이용해서 데이터를 핸들링 할때 크게 다음 5개의 파이프라인 사용이 가능합니다.

• cellranger mkfastq
• Demultiplexing BCL(raw base call) files → FASTQ files bcl2fastq
• cellranger count
• Illumina single cell FASTQ가 주어진다면 가장 흔하게 사용되는 파이프라인입니다. Alignment, filtering, barcode counting, UMI counting 을 포함하고 있으며 이를 이용해서 feature-barcode matric (count)생성합니다.
• cellranger multi
• Multiplexing (데이터들이 합쳐져 있어서 demultiplexing이 필요한 경우) 데이터를 분석하기위한 파이프라인입니다.
• cellranger aggr
• normalize count output (sequencing depth) and combine
• cellranger reanalyze
• counts 데이터에 parameter setting 을 조정하여 다시 분석 할 수 있습니다.

** 보통은 1 GEM → 1 Library (or 1 sample)

** 10x 홈페이지에서 설명하는 1 sample, multiple GEM 경우, 단일 샘플로 실험을 2회 이상 진행하는 것을 의미합니다. 단일 세포 경우 몇십만~몇백만 세포를 가지고 있는데, 실제 1개의 GEM 에서는 보통 약 1~2만개의 세포데이터를 확보하기에 sequencing depth를 늘려주기 위해서 여러번 (multiple flow cells) sequencing 하는 것입니다.

 

Input FASTQ 형식

[Sample Name]S1_L00**[Lane Number]**[Read Type]_001.fastq.gz

Where Read Type is one of:

• I1: Sample index read (optional) - 8nt i7 sample index
• I2: Sample index read (optional)
• R1: Read 1 - cell barcode (16nt) + UMI seq (10nt)
• R2: Read 2 - cDNA (98nt 3’ to 5’)

illumina sequencer 마다 정보가 조금씩 다를 수 있다. 위에 적은 설명은 single cell 3’ v2 관련한 설명입니다.

• https://davetang.org/muse/2018/06/06/10x-single-cell-bam-files/ 여기서 bam 관련 설명 강추!!
• expression/documentation/steps/sequencing/sequencing-requirements-for-single-cell-3 https://davetang.org/muse/2018/06/06/10x-single-cell-bam-files/

 

 

 

Gene Expression Algorithms Overview

Cell ranger 에서 alignment, trimming, and counting 을 할때, 어떤 과정을 거치는지 조금 더 자세히 다뤄보겠습니다. 

** Intron = intragenic regions: located within protein-coding genes but are removed before a protein is made (include regulatory elements such as enhancers)

** intergenic regions ~ located between genes ~ junk DNA

 

Alignment

Read Trimming

Full length cDNA construct 에는 5’ end 에 30bp template switch oligo (TSO) sequence 가 3’ 에는 poly-A 가 달려있습니다.. Alignment 전에 TSO 와 3’ poly-A를 제거해줌으로써, sensitivity of the assay 를 향상시켜줍니다.

** BAM 파일의 ts:i , pa:i 는 각각 # of trimmed TSO , # of trimmed poly-A-nucleotides 을 보여줍니다.

 

 

Genome Alignment

STAR (splicing-aware alignments of reads) 을 이용하여 alignning 하고, GTF (transcript annotation)을 이용하여 해당 reads 가 exonic, intronic, intergenic 중 어디에 속하는지 나눠줍니다. 이때, reads 의 50% 이상이 exon 부분과 교차한다면 exonic으로 분류되고, 나머지중 intron과 교차되는 reads는 intronic 나머지는 intergenic으로 분류됩니다.

 

 

MAPQ adjustment

MAPQ =255 이면 reads 가 확실히 exonic locus 라는 의미입니다.

 

 

Transcriptome alignment

• 하나의 gene 에 mapping 된 reads 만 이용하여서 UMI counting 을 진행합니다.
• include-introns = false 설정 가능합니다.

 

10x barcode correction

읽힌 barcode 와 알고있는 barcode sequence (barcode whitelist file) 를 비교해 correction 을 진행해줍니다. 만약에 읽힌 barcode 가 whitelist 에 존재하지 않고 one Hamming distance 차이가 난다면, whitelist barcode 랑 비교하여 가장 posterior probability 가 높은 barcode 로 바꿔줍니다.

BAM → CR: original barcode , CB: corrected barcode

 

 

UMI counting

transcriptome 에 mapped 된 reads 들을 한그룹으로 다 모으는데 이때, 다른 그룹과의 UMI 가 같거나 one hamming distance apart 이면 error 라고 생각하고 UMI with higher support 로 바꾸어줍니다. UMI 수정후에 reads 들을 bacode, UMI, gene annotation을 이용해서 그룹핑 해주는데 이때 같은 barcode 와 UMI 가 같은 reads들이 다른 gene annotation을 갖고있다면, 그중 most supporting reads 만 UMI counting 에 이용됩니다. 만약에 한 reads 가 뚜렷하게 더 좋지 못하면, 해당 read groups을 다 버립니다.

위의 2가지 filtering step → unfiltered feature-barcode matrix

** filtered feature-barcode matrix 는 only detected cell-associated barcodes 만을 포함합니다.