[ Bioinformatics 논문 ] "An efficient targeted nuclease strategy for high-resolution mapping of DNA binding sites"

 

"An efficient targeted nuclease strategy for high-resolution mapping of DNA binding sites"

Skene and Henikoff  Jan, 2017

 

Abstract

Cleavage Under Targets and Release Using Nuclease (CUT & RUN) 

Cut & Run 역할: 

1. quantitative high-resolution chromatin mapping
2. probing(자세히 조사) of the local chromatin environment 

장점: Simple, robust, need ~1/10th the sequencing depth as ChIP (low background data) 

따라서 in situ mapping of protein-DNA interaction 에 Chip-seq 대신 CUT&RUN 이 사용 가능하다. 

 

 

 

eLife digest

Transcription factors (TFs) 라고 불리는 단백질은 DNA에 붙어서 주의에 있는 유전체들을 On (발현시키거나) / Off (불발) 한다. TFs는 histone과 같은 프로틴과도 interact 한다.  이러한 TFs, histones 혹은 chromatin과 연관된 다른 프로틴들은 모두 nearby gene의 active 조절을 한다. 

어떠한 TFs나 chromatin-associated protein 이 DNA의 잘못된 부분에 붙게되면, 인간의 몸에서 질병을 일으킬 수 있다. 암 또한 이중 하나이다. 이러한 이유 때문에 많은 Researcher들이 다양한 상황에서의 specific DNA-binding proteins의 위치를 찾는데 많은 흥미를 갖는다. chromatin immunoprecipitation (ChIP)이라 불리는 기술은 이를 할 수 있게 해주었고 널리 사용되었지만 꽤 문제점이 있었기에 대안방안을 찾았다. 그것이 바로 CUT&RUN (cleavage under targets & release using nuclease) 방법이다 .

 

CUT&RUN compare to ChIP

장점 1. ChIP과 다르게 DNA가 있는 cells을 처음에 부수지 않아도 된다. 이는 즉 protein-DNA Interaction의 natural state가 보존된다 말할 수 있다. 
장점 2: antibody binds to protein interest in intact (온전한) cells, cuts out the DNA --> releasing the DNA fragment from cells
장점 3: 적은 양의 cell로 실험을 시작할수 있다.  

 

 

 

Introduction

Chip-seq -> TFs profiling (transcription factors 의 위치 파악)

X-ChIP (formaldehyde crosslinking ChIP), and with ChIP-seq, base-pair resolution mapping of TFs became feasible (Rhee and Pugh, 2011; Skene and Henikoff, 2015; He et al., 2015).

 

Chip-seq (1980s)

: Chromatin Immunoprecipitation

역할: protein interacted DNA sequencing = cofactor, histon localizing

단점: 대량의 sample이 필요하다. chromatin을 sonication으로 랜덤하게 절단해서 target DNA 부분도 절단되어버리는 경우가 있다. 

 

ATAC-seq (2013) Epigenetics 정보 얻기 - DNA methylation, histone 변형 (acetylation), noncoding-RNA

: Assay for Transposase Accessible Chromatin with high-throughput sequencing

https://www.abpbio.com/product/tn5-transposase/ 

Tn5 Transposase | ABP Biosciences

=> chromatin accessibility: tn5 transposage(인공합성) 을 이용하여 Euchraomatic (open) chromatin 에 adaptor을 붙이고 sequencing. 

장점: fragmentation, library(adopter 붙이는 것) 를 한번에 실행  

 

Cut & Run (2017)

Cut & Tag (2019) 

장점:

[1] 5,000~ 50,000 cells 적은 sample로 실험 가능 

[2] transposage가 target protein에 붙어서 그 근방만 절단 -> Low background data 가능하다. 

 

 

(좌) ChIP-seq https://www.nature.com/articles/s41596-020-0373-x (우) CUT & RUN

 

Results

- Cut&RUN produces limit digestion of chromatin complexes 

Total DNA extraction ~ purification of small fragments

 

- Cut&RUN robustly maps yeast TF binding sites in situ at high resolution

In situ research involves removing cells, hormones, or proteins from a living organism and then preserving them to be studied in a laboratory environment.

 

- CUT&RUN precisely maps chromatin-associated complexes

 

- CUT&RUN resolves rare insoluble DNA-binding protein complexes

 

- CUT&RUN probes nearby chromatin

 

- CUT&RUN maps human transcription factor binding sites at high resolution

 

- CUT&RUN maps histone modifications in compated chromatin

 

- CUT&RUN directionally maps long-range genomic contacts

 

- CUT&RUN allows quantitative measurements with low cell numbers